PCR檢測試劑盒使用說明

1：樣品準(zhǔn)備：取1毫升細(xì)胞培養(yǎng)上清(貼壁和懸浮細(xì)胞都可以，已培養(yǎng)48小時以上)，在16000g離心5分鐘，小心棄去上清，避免丟失沉淀(沉淀量有可能很少，目視看不到)。將沉淀用無菌PBS重懸，在16000g離心5分鐘，同樣小心棄去上清，如此反復(fù)用無菌PBS洗三次。后將獲得的沉淀用100微升超純水重懸，置于100℃水浴中孵育5分鐘。如此制備好的樣品可在4℃保存1到2個月。

2：PCR反應(yīng)的準(zhǔn)備：

待各組份融化后先瞬時離心，然后輕彈混勻。按下表在已滅菌的PCR管中配制反應(yīng)體系，每次實驗需加一個陰性和一個陽性對照，測試反應(yīng)管可以有多個。配制過程中應(yīng)注意無菌，并注意避免操作產(chǎn)生的氣溶膠造成樣品間的交叉污染，推薦在有風(fēng)壓的設(shè)備如超凈臺或生物安全柜中進(jìn)行操作。建議配制完畢后瞬時離心以使液體沉至管底。

3：PCR反應(yīng)：

降落PCR法(Touchdown PCR)：94℃變性2分鐘;首循環(huán)：94℃變性30秒，68℃退火30秒，72℃延伸45秒;從第二到八個循環(huán)開始，每循環(huán)退火溫度下降1℃，其余不變;從第九個循環(huán)開始，反應(yīng)條件固定為：94℃變性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸45秒，循環(huán)32次;循環(huán)結(jié)束后，在72℃延伸7分鐘，后保持在4℃。

4：瓊脂糖凝膠電泳：

按常規(guī)方法準(zhǔn)備好2%瓊脂糖凝膠，加入EB或Gold-View等用于顯色。每份反應(yīng)液取8微升，無須加入上樣緩沖液，直接加入凝膠加樣孔中，另留一孔加入DNA marker(要求在400-700bp區(qū)間有顯示條帶)，120伏電泳約30分鐘。在紫外線下觀察電泳結(jié)果，陽性對照應(yīng)在643bp處有一條帶，陰性對照無條帶，檢測條帶在438-470bp區(qū)間。

PCR檢測試劑盒注意事項

1：組份A中含有染料，染料的加入不影響PCR反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物可直接電泳，節(jié)省時間。

2：本試劑盒檢測范圍涵蓋支原體所有種屬，真核細(xì)胞和革蘭氏陰性菌不會造成干擾，與支原體親緣關(guān)系較近的革蘭氏陽性菌在反應(yīng)中的靈敏度較支原體低1000-10000倍。

3：本試劑盒適用于檢測支原體感染，客戶如需區(qū)分感染的種屬，可將PCR產(chǎn)物切膠然后測序，進(jìn)行序列比對即可知種屬類型。

4：有時可直接用細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行PCR反應(yīng)。培養(yǎng)上清中常含有高濃度的PCR抑制劑，可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果，故不建議使用此法。有些PCR抑制劑用離心可以除去，若離心不能去除，則推薦抽提基因組DNA進(jìn)行PCR。而某些PCR抑制劑，如黑色素，通過抽提基因組DNA也不能去除，此時可以通過加入高濃度(如2%)的BSA(牛血清白蛋白)中和其抑制活性。

5：假陰性結(jié)果判斷方法：在測試反應(yīng)管中同時加入測試樣品和陽性對照樣品，觀察對照條帶是否出現(xiàn)。在陽性對照管出現(xiàn)對照條帶的情況下，如果測試反應(yīng)管的對照條帶和檢測條帶都沒有出現(xiàn)，則可判斷為PCR反應(yīng)受到了抑制，即假陰性結(jié)果。陽性對照管如果沒有出現(xiàn)對照條帶，請檢查PCR條件是否恰當(dāng)，或者與技術(shù)支持聯(lián)系。

6：每個測試樣品建議做兩個反應(yīng)：一個與陽性對照樣品共同反應(yīng)，排除假陰性結(jié)果，另一個單獨反應(yīng)，可避免因加入陽性對照樣品所致的靈敏度降低。如果測試樣品中支原體含量很高，可能會抑制陽性對照條帶的出現(xiàn)。