【儀表網 研發快訊】在生物學研究的前沿，對活體組織中復雜三維亞細胞動態的非侵入性解析需求日益增長。為了實現空間分辨率、成像深度、光毒性三者的同時優化，北京大學席鵬教授團隊將共聚焦掃描成像與結構光超分辨巧妙結合起來，提出一種多點晶格共聚焦圖像掃描顯微解決方案，通過優化針孔直徑和間距、消除離焦信號和引入減幀重建算法來克服現有技術在時空分辨率平衡方面的局限性，極大地擴展了超分辨率成像在生物體內的應用范圍。
 

　　隨著生物醫學的快速發展，在組織層面揭示其內部三維精細結構、捕捉快速生物動態過程等成像需求日益增加。共聚焦激光掃描顯微技術因其卓越的光學切片能力和多功能性，在散射組織的深度成像中一直被視為首選。然而，縮小針孔尺寸以提升分辨率會導致信號下降，限制成像質量。圖像掃描顯微技術(Image Scanning Microscopy，ISM)通過將單點探測器替換為探測器陣列，基于像素重定位和解卷積算法，在保持共聚焦層切能力的同時實現了相比于衍射極限兩倍的分辨率提升。相比于其他超分辨顯微技術，ISM更能抵抗深度成像時所引起的像差和散射等問題。
 

　　席鵬團隊提出多點共聚焦多點共聚焦圖像掃描顯微(Multi-confocal Image Scanning Microscopy，MC-ISM)技術，通過晶格針孔陣列產生多焦點照明，相比于傳統ISM利用單點進行掃描，這種并行化的配置配合類似阿基米德螺線的單振鏡掃描，極大提高了全視場成像速度。通過優化針孔直徑和間距、應用光學鎖相探測(OLID)處理抑制離焦信號，提高成像質量。基于像素重定位和進一步的解卷積后處理，MC-ISM可實現2倍的三維分辨率提升。此外，通過引入多圖反卷積重建算法進行減幀重建，MC-ISM可進一步提高成像速度，比多焦點結構光照明顯微鏡提高了16倍。
 

圖1. MC-ISM光路圖以及像素重分配和減幀重建結果
 

　　研究團隊利用MC-ISM技術對小鼠腎切片進行了三色3D超分辨成像，在66.5μm×66.5μm×12μm的體積內，以150nm的軸向間隔實現了絲狀肌動蛋白、腎單位成分及核結構的清晰分離，橫向與軸向分辨率分別提升至131nm和336nm。MC-ISM有效抑制了離焦信號，展現出與轉盤共聚焦顯微鏡相當的光學切片能力。此外，使用20倍長工作距離物鏡，MC-ISM對DAPI染色的斑馬魚頭部進行深層成像，同樣展現出卓越的性能，在整個成像體積內細胞結構清晰可見。相較于寬場和共聚焦模態，分辨率顯著提升。
 

圖2. MC-ISM小鼠腎切片組織樣本和斑馬魚成像結果
 

　　MC-ISM因其簡化的探測光路而展現出增強的光子收集效率。在相同信噪比條件下，MC-ISM在1000幀成像后的熒光強度下降至67%，表明其光漂白程度低于OMX結構光照明顯微鏡、超分辨轉盤共聚焦顯微鏡和Airyscan超分辨顯微鏡。此外，MC-ISM以7.5幀每秒的速度對U2OS細胞中的線粒體進行成像，過程中線粒體未發生腫脹現象，表現出成像系統極低的光毒性。在植物細胞中，MC-ISM成功克服了組織散射和自發熒光，實現了對擬南芥下胚軸內線粒體的原位超分辨成像，展示了其在厚植物組織中超分辨成像的獨特優勢。這些結果證明了MC-ISM系統在研究線粒體動態方面的優越性和廣泛應用潛力。
 

圖3. MC-ISM動物細胞線粒體和擬南芥下胚軸植物組織線粒體動態成像結果
 

　　破衍射極限現細胞真顏，執細膩筆觸繪生命畫卷。憑借專門的硬件設計與先進算法的完美協同，MC-ISM深入樣本內部，精細觀察組織深層結構，以高速度捕捉瞬息萬變的生命體動態。其較低的光毒性使細胞得以自然地展現其生命力，從而揭示了生物體內復雜三維結構的奧秘。MC-ISM與現有共聚焦系統的高度兼容性，加之其成本效益和操作簡便性，使其成為引領下一代共聚焦顯微技術的強有力競爭者。
 

　　該成果以“Expanding super-resolution imaging versatility in organisms with multi-confocal image scanning microscopy”為題發表于National Science Review(IF：16.3)。北京大學未來技術學院博士生任偉、關美玲(現為中國科學院空天院博士后)和梁謙禧為共同第一作者。席鵬、北京大學生命科學學院李美琪為本文的共同通訊作者。論文主要貢獻者還包括北京大學蘇都莫日根教授，金博雅博士，博士生段光興、張麗雅、侯宜偉，河北大學高保祥教授和研究生蓋希川。本工作得到科技部重點研發計劃、國家自然科學基金的支持，也得到北京艾銳精儀科技有限公司、北京大學國家蛋白質科學中心和光飛納科技公司的幫助。