【儀表網 研發快訊】核磁共振方法除可獲得分子結構信息外，還可觀測分子的動態特性，這些可為闡明蛋白質等生物大分子的功能機制提供重要信息。隨著高速魔角旋轉技術的發展，固體核磁譜分辨率大幅提高，從理論上突破了液體核磁觀測的分子量的限制，逐漸被運用于研究磷脂膜環境中的膜蛋白等超大生物分子復合物體系的動態構象。但低信號強度和低分辨率限制了生物分子固體核磁研究的廣泛開展。自然界中氫原子和氟原子的旋磁比大、NMR信號強，是比較理想的NMR觀測對象。氟原子在生物分子結構中極少存在，無觀測背景信號，是理想的NMR觀測探針。因此，氫檢測和氟檢測方法的發展可能顯著擴展固體核磁在復雜生物體系中的運用。
 

　　2023年8月23日，中國科學技術大學微尺度物質科學國家研究中心史朝為課題組在國際著名學術期刊ScienceAdvances上在線發表了題為“Fluoride permeation mechanism of the Fluc channel in liposomes revealed by solid-state NMR”的研究論文，研究團隊以氟離子通道蛋白Fluc-Ec1作為研究對象，結合氘代和19F定點標記方法，發展并優化膜蛋白固體核磁氫檢測及氟檢測研究方案，為膜蛋白核磁研究提供新思路。
 

　　環境中的氟離子可通過弱酸積累效應在細菌細胞內積累，產生毒害作用。微生物通過F-膜轉運蛋白將F-運輸至體外進而抑制其毒性作用。來自Fluc(fluoridechannel)家族的Fluc-Ec1蛋白是由130個左右的氨基酸組成的離子通道，具有獨特的雙重拓撲二聚體的結構，且對氟離子具有高度選擇性。靜態的F-通道蛋白的晶體結構難以描述F-滲透的具體機制，F-通道蛋白被抗體類似物固定在一種構象上。氟原子和氧原子相似的電子云密度以及分子動力學模擬數據使得晶體結構中極性軌道(polartrack)上的氟離子結合位點(F1and F2sites)引發爭議，另外突變體功能保留或喪失的機制目前仍不清楚。
 

　　研究團隊通過觀測磷脂膜環境中的Fluc-Ec1在不同氟離子濃度中的構象，結合基因密碼子擴展方法，在蛋白質前庭位置引入非天然氨基酸三氟甲基苯丙氨酸(tfmF)，設計19F-19F自旋擴散實驗，驗證了Fluc-Ec1存在新的氟離子結合位點(F0site)。研究團隊利用1H-1H自旋擴散實驗直接檢測水和蛋白質的相互作用，通過氘代來減少氫原子的非相干背景，結合water-hNH譜圖以及自旋擴散傳遞和衰減規律，得到了主鏈酰胺質子和水分子的距離信息，證明了F1位點結合的是水，而不是氟。
 

　　此外，晶體學研究無法從結構的角度解釋F80M突變體具有功能活性而F83M突變體喪失功能活性的現象，研究團隊通過分別對比F80M、F83M和野生型蛋白脂質體樣品的碳檢測譜圖，結合液體核磁共振技術驗證loop 1突變體功能，發現loop 1是F83M突變體喪失通道活性的重要因素，進一步揭示了loop 1在F-滲透過程中的重要性。綜上，研究團隊更正了先前推測的氟離子通道離子配位位點，提出氟-水交替“water-mediated knock-on”的滲透模型，為全面理解Fluc通道中的滲透和門控機制提供科學依據。
 

　　中國科學技術大學張瑾、宋丹、李娟以及德國亞琛工業大學的Florian Karl Schackert為該論文的共同第一作者，中國科學技術大學微尺度物質科學國家研究中心史朝為特任研究員為該文章的通訊作者。中國科學技術大學的龔為民教授、田長麟教授、項晟祺教授以及德國Jülich研究中心的Paolo Carloni和Mercedes Alfonso-Prieto教授團隊也參與了該研究工作并給予了大力幫助。該研究得到了科技部、國家自然科學基金、中國科學院、中國科學技術大學以及德國科學基金會的經費資助。　(合肥微尺度物質科學國家研究中心、科研部)