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實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)操作步驟：
1、RNA提取：
針對(duì)莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)RT引物，RNA正常提取就好;對(duì)于Oligod(T)特異的RT引物，盡量用特殊試劑盒提取miRNA。
2、反轉(zhuǎn)錄：
反轉(zhuǎn)錄過程對(duì)酶沒有特殊要求，操作按照反轉(zhuǎn)錄酶的說明書進(jìn)行。對(duì)于引物，在反轉(zhuǎn)錄過程中只需加入Oligod(T)特異的RT引物或莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)RT引物，不需要另外添加其他RT引物。用Oligod(T)特異的RT引物時(shí)，RNA需要進(jìn)行3'Poly(A)加尾處理。
內(nèi)參基因不需要單獨(dú)設(shè)計(jì)RT引物，可以用熒光定量PCR的反向引物作為RT引物。
3、熒光定量PCR：
先優(yōu)化PCR體系(引物濃度、退火溫度等)，進(jìn)行引物測試，確保擴(kuò)增曲線正常且溶解曲線為單一的尖峰，陰性對(duì)照無擴(kuò)增，則引物測試合格，再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(常規(guī)操作)。
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